聚焦真人电影男主Larry Daley的儿子Nick Daley，他不情不愿地也成为了一名博物馆管理员，而《博物馆巧妙夜2》里的卡门拉法老又回来了，想要降服世界。

由于在纽约自然历史博物馆担任警卫有出色表现，拉瑞（本·斯蒂勒BenStiller饰）出任某家电小公司的CEO，而且还在电视上接受了著名脱口秀掌管人的访谈，儿子对他敬慕，爱情如影随形，一派春风自得的样子。不过，好景不长，当他故地重游，却不测发现馆长曾经由于更新展览并预备把过时的展品挪到华盛顿的史密森博物馆继续展出。这让拉瑞感到有些气愤，他觉得自己有责任重振博物馆之雄风，于是他决议留上去再做一晚警卫，

拉里·达利（本·斯蒂勒 饰）生活似乎不太顺利：经常换义务，居无定所；妻子与他离婚，找了一个证券经纪人，行将再婚，自己在儿子心目中的位置也危如累卵 　　达利为了拯救自己的生活，也为了争取到儿子的抚养权，他不得不坚持“做大事”的梦想，成为了纽约自然博物馆的夜间警卫 　　达利原本 以为这是一份无聊的义务，谁知道下班的第一天，不可思议的事情就发作了：博物馆里的法老金牌拥有神奇的魔法，当